Samenvatting

In het St. Antonius ziekenhuis(AZN) is er een onderzoek gestart om de klonale verwantschap tussen twee longtumoren, afkomstig van één patiënt, te bepalen met Next Generation Sequencen (NGS). Er wordt hierbij in 50 genen gezocht naar mutaties. Als de twee longtumoren overeenkomende mutaties hebben in dezelfde genen kan men zeggen dat de longtumoren klonaal verwant zijn (metastase) en als de mutaties niet overeenkomen kan men zeggen dat de tumoren een andere primaire oorsprong hebben. Dit is van belang voor de verdere behandeling van de patiënt.
Men wil de resultaten van dit onderzoek gaan vergelijken met de resultaten van de p53 mutatie analyse, dit is een conventionele methode om klonale verwantschap aan te tonen tussen tumoren. Het probleem is echter dat deze analyse niet aanwezig is in het laboratorium. Het doel van deze scriptieopdracht is dan ook om een p53 mutatie analyse op te zetten, om zo de klonale verwantschap tussen twee longtumoren in één patiënt te bepalen.

De analyse bestaat uit het amplificeren van exonen uit het TP53 gen middels Polymerase Chain Reaction (PCR) en sequencen volgens de Sanger methode om de sequentie te verkrijgen. Als er in beide tumoren exact dezelfde mutatie aanwezig is in het TP53 gen, kan men concluderen dat zij klonaal verwant zijn. Echter heeft één enkele tumor een mutatie of beide tumoren een andere mutatie kan men spreken van twee longtumoren met verschillende primaire oorsprong.

Eerst werd de analyse opgezet op benigne weefselmateriaal. Na optimalisatie werd de analyse uitgevoerd op tumormateriaal van vijf patiënten met dubbele longtumoren. Op dit tumormateriaal had het Universitair Medisch Centrum Utrecht(UMCU) eerder een p53 mutatie analyse uitgevoerd. De oorspronkelijke resultaten van het UMCU werden vergeleken met de resultaten van het AZN, zodat bepaald kon worden of de analyse van het AZN goed werkt.

Op het DNA, geïsoleerd uit geparaffineerd weefsel, is exon 5 tot en met 8 van het TP53 gen geamplificeerd en gesequenced. Deze exonen coderen voor het core-domein van het p53 eiwit en volgens de literatuur worden hier de meeste mutaties aangetroffen. Voor zowel de amplificatie als de sequentiereactie zijn twee primersets getest afkomstig uit de twee verschillende artikelen van Van der Sijp et al. en Angelopoulou et al.
Beide primersets geven goede resultaten voor exon 7 en 8 bij het benigne weefselmateriaal. Echter voor exon 5 en 6,bij primerset Van der Sijp et al,. worden slecht beoordeelbare sequenties verkregen.
De primerset Angelopoulou et al. verkrijgt ook slecht beoordeelbare sequenties bij exon 6 en goed beoordeelbare sequenties bij exon 5, echter wordt er tijdens de PCR van exon 5 sporadisch een PCR-product verkregen.
Het optimaliseren van de PCR voor exon 5 geeft bij beide primersets weinig verbeteringen bij de vorming van een PCR-product. Tevens is er door het tijdschema weinig tijd overgebleven om de PCR en sequentiereactie van exon 6 te optimaliseren.
Aangezien exon 5 een beter beoordeelbare sequentie verkrijgt bij de primerset van Angelopoulou et al. dan bij de primerset van Van der Sijp et al., is er voor gekozen om de primerset van van Angelopoulou et al. te gaan testen voor de p53 mutatie analyse op tumormateriaal.

Van vijf patiënten met dubbele longtumoren, verkrijgt de p53 mutatie analyse in het AZN bij vier patiënten hetzelfde resultaat als in het UMCU. Bij één patiënt wordt er een mutatie gemist, een reden hiervoor kan zijn dat het tumorpercentage te laag was om de mutatie in de sequentie te kunnen detecteren.
Bij deze vijf patiënten worden goede resultaten verkregen voor exon 7 en 8. Echter net als bij de opzet op benigne weefselmateriaal zijn exon 5 en 6 nog niet optimaal, waar exon 5 niet altijd een PCR-product verkrijgt en exon 6 slechte forward sequenties geeft.

Op basis van de resultaten kan men concluderen dat de p53 mutatie analyse goed werkt voor exon 7 en 8. Voor exon 5 en 6 moet echter de PCR en het sequencen nog verder geoptimaliseerd worden, om ook hier een goede sequenties te verkrijgen voor het vinden van mutaties.
Om de PCR van exon 5 en 6 te optimaliseren kan de primer concentratie nog aangepast worden, deze is waarschijnlijk te hoog. Een hoge concentratie kan zowel inhibitie veroorzaken van de PCR bij exon 5 als aspecificiteit bij exon 6.