Samenvatting

Inleiding: Phenylketonurie is een veel voorkomende aangeboren aandoening die wordt veroorzaakt door een mutatie in het enzym phenylalanine hydroxylase. Hierdoor wordt het animozuur phenylalanine niet afgebroken. De opstapeling van phenylalanine is toxisch en hindert de ontwikkeling van de hersenen. Patienten volgen daarom een eiwit arm dieet en worden regelmatig gecontroleerd door een metabool arts op hun phenylalanine concentratie.
De huidige analyse van phenylalanine in bloed spots wordt gemeten als butyl derivaat met flow injectie analyse gekoppeld aan tandem massa spectrometrie (FIA-MS/MS), hierbij wordt het metaboliet tyrosine ook mee gemeten. Het nadeel van deze methode is dat isomeren met dezelfde massa als phenylalanine en tyrosine niet worden gescheiden en dat de monsteropwerking relatief lang duurt. Het doel van dit onderzoek: de ontwikkeling een methode waarbij gebruik wordt gemaakt van high pressure liquid chromatografie gekoppeld aan tandem massa spectrometrie (HPLC-MS/MS) voor de analyse van phenylalanine en tyrosine in DBS als FMOC derivaat. De chromatographische methode voor de analyse van phenylalanine en tyrosine moet vrij zijn van interferentie, een korte analyse tijd hebben en envoudig genoeg zijn voor het gebruik van routine-samples.
Methode: Voor de analyse van phenylalanine en tyrosine met HPLC-MS/MS werd gebruikt gemaakt van FMOC als derivaat. De analieten werden gedetecteerd met multiple reaction monitoring (MRM). Bij de ontwikkeling van de nieuwe HPLC methode werden verschillende HPLC kolommen getest, op basis van piekvorm werd de geschikte kolom gekozen. Bij deze kolom werd er een factorial design voor het eluens gemaakt. Na de optimalisatie van de samenstelling van het eluens werd de flowrate geoptimaliseerd waarbij gebruik werd gemaakt van peakcapacity. Met de oude methode en de nieuwe geoptimaliseerde methoden werden er 103 samples gekwantificeerd met een kalibratielijn. Om te kijken of waarden van de nieuwe methode overeen komen met die van de oude methode en nog klinisch verantwoord zijn, werden beide methoden ten opzichte van elkaar vergeleken met regressie analyse en Blant-Altman plots.
Resultaten: Tijdens de optimalisatie van de HPLC methode werd er een stoorpiek gescheiden in de overgang van phenylalanine en in de overgang van de interne standaard voor tyrosine. Met de Atlantis kolom vond de beste scheiding plaats. De kolom gaf de beste prestatie bij een flow van 0,4 mL/min met een lineair gradiënt van 3 minuten met een binair eluens dat bestond uit A) 80/20 ACN/H20 met 125 mg/L ammonium formaat en B) 30/70 ACN/H20 met 125 mg/L ammonium formaat.
De resultaten van de concentratie phenylalanine en tyrosine met de HPLC-MS/MS als FMOC derivaat correleerde sterk met het resultaat van de FIA-MS/MS als butyl derivaat. Bij de Blant-Altman plots werden wel verschillen opgemerkt. Bij lage concentraties voor phenylalanine gaf de FIA-MS/MS als butyl derivaat veel fouten die de 2 sd grens overschrijden. Dit werd veroorzaakt doordat bij de kalibratielijn voor phenylalanine het hoogste punt afvlakten, hierdoor werd de kalibratielijn onbetrouwbaar. De kalibratielijn van de HPLC-MS/MS als FMOC derivaat bleef over een groter bereik lineaer. Voor tyrosine waren de waarden voor de HPLC significant hoger ten opzichte van de waarden verkregen met FIA-MS/MS maar er was geen duidelijke trend.
Conclusie: Er is een HPLC-MS/MS methode ontwikkeld voor de analyse van phenylalanine en tyrosine als FMOC derivaat. Bij het gebruik van HPLC-MS/MS werd er een stoorpiek gescheiden in de transitie van phenylalanine en de interne standaard voor tyrosine. Daardoor is de nieuwe methode is preciezer. Bovendien is de monstervoorbewerking sneller en heeft de nieuwe methode ook een groter lineair bereik.